血必净在炎症研究方面的相关研究进展

　

血必净在炎症研究方面的相关研究进展

一、炎症模型及检测指标

1.细胞模型（1）RAW.7细胞模型：巨噬细胞是机体内一种重要的免疫细胞，在抗炎、抗肿瘤、机体免疫调节等方面发挥着重要的生理作用。使用1μg/mLLPS（或1μg/mLLPS刺激18h或1.2μg/mLLPS）刺激24h建立RAW.7细胞炎症模型。研究指标：NO/iNOS/COX-2：炎症反应发生时，致炎物或炎症介质可诱导或增加局部NO的合成和释放。iNOS在炎症反应中被诱导产生，生成大量NO，促进炎症反应。COX有3种同工酶：COX-1、COX-2、COX-3，其中COX-2为诱导酶，催化AA裂解为前列腺素等致炎介质的关键酶，与炎症的关系非常密切。

ROS：炎症细胞是活性氧的有效来源，在炎症疾病的发展中起着重要作用。高浓度的活性氧对细胞有害，可直接激活炎症途径，导致局部产生促炎细胞因子。

促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β),趋化因子(IL-8)：TNF-α是巨噬细胞激活剂和免疫反应的引发剂。IL-6和IL-1β可以激活巨噬细胞。IL-8作为趋化因子的一员，在炎症中被多种细胞过度分泌。

（2）HUVEC细胞模型：在炎症反应中，内皮细胞不仅是其中被动的靶细胞，同时也是效应细胞。内皮细胞通过其自身的屏障、分泌和粘附功能，影响炎症的发展。内皮细胞的炎症反应过程以募集多种细胞因子和粘附分子为主，并最终引起主动免疫反应和内皮细胞的功能障碍。使用1μg/mLLPS刺激2/4h（或ng/mLLPS刺激24h）建立HUVEC细胞炎症模型。

检测指标：对中性粒细胞（PMN）的黏附能力：炎症反应发生时，（非特异性免疫构成人体的第一道防线）。中性粒细胞（PMN）迅速黏附至血管内皮细胞并聚集于炎症发生处。

膜分子（CD、CD40、ICAM-1）：ICAM-1是细胞间相互作用时,最早发挥作用的细胞间薪附分子。CD40/CD40L是双向信号分子对,可引起内皮细胞活化，进T细胞的黏附和迁移,又参与抗原特异性细胞的诱导和增殖。CD分子，当它作为细胞表面的受体时,介导活化信号,促进细胞的活化、增殖,而当其作为配体提供信号时,则诱导细胞凋亡。

细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1）黏附因子（ICAM-1、VCAM-1)：TNF-α是巨噬细胞激活剂和免疫反应的引发剂。IL-6和IL-1β可以激活巨噬细胞。IL-8作为趋化因子的一员，在炎症中被多种细胞过度分泌。

（3）HCT-细胞模型：肠上皮是胃肠道粘膜先天免疫系统的防御前线。使用ng/mLLPS（或、ng/mLLPS）刺激24h建立HCT-细胞炎症模型。

检测指标：NO/iNOS/COX-2：炎症反应发生时，致炎物或炎症介质可诱导或增加局部NO的合成和释放。iNOS在炎症反应中被诱导产生，生成大量NO，促进炎症反应。COX有3种同工酶：COX-1、COX-2、COX-3，其中COX-2为诱导酶，催化AA裂解为前列腺素等致炎介质的关键酶，与炎症的关系非常密切。

ROS：脂多糖(LPS)是一种内毒素，它来源于细菌，在胃肠上皮细胞中引起过量的ROS生成和强烈的促炎反应。

炎症小体识别分子（NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP12、NLRC4、NLRC5、NAIP、AIM2）炎症因子（IL-1β、IL-18）

（4）THP-1细胞模型：

将THP-1细胞接种于六孔板，密度为(1～2)×/ml，每孔细胞中加入浓度为mg/L的PMA，刺激48h后细胞形态学上转变为椭圆形、梭形或伸出伪足，由悬浮状态转变为贴壁状态，表明THP-1细胞已成功转化为巨噬细胞，在巨噬细胞内加入LPS（ng/ml），共培养刺激6h建立炎症模型。

检测指标：IL-10、IL-12、TNF-α：IL-10作为免疫抑制因子，通过抑制多种效应分子来抑制机体的抗肿瘤免疫，通过诱导产生IL-2，IFN–C，抑制IL-12及TNF-α的表达，从而抑制了细胞免疫应答。IL-12通过诱导辅助T细胞分化，促进辅助Th1细胞增殖来参与细胞免疫。

2.动物模型

（1）脓毒症大鼠模型：雄性清洁级Wistar大鼠,体重-.0g,术前禁食12小时。氯胺酮注射液+速眠新注射液Ⅱ2：1混合液0.04mL/mg肌肉注射麻醉。固定,常规消毒,腹部正中切口暴露盲肠,结扎盲肠与回肠连接处。以穿刺针贯穿盲肠侧,用引流条穿过盲肠,共穿孔2-3个,复位后缝合皮肤。生理盐水10mL颈背部皮下注射复苏，单笼饲养。

检测指标：F0xp3、CTLA-4、IL-10、TNF-α、IL-1β：在脓毒症早期促炎反应为主时,就已经发挥了强力的抑制功能,只是这种抑制功能还不能抵消促炎反应,表现为促炎反应为主。

心肌损伤标志物（TnT、CK-MB、H-FABP、BNP）：血流动力学改变在脓毒症休克和MODS的发生发展中起关键作用，心脏是血液循环的动力器官，也是脓毒症的易损伤器官。心肌损伤标志物检测能精确探测心肌损伤严重程度和心功能障碍，并对评估脓毒症患者预后有重要意义。

（2）急性肺损伤（ALI)大鼠模型：大鼠麻醉后，沿腹中线做一条长1.5cm的切口，取出盲肠，距盲端5cm处结扎，用12号针在盲肠上穿通2次形成盲肠漏，将盲肠放回腹腔，逐层缝合腹壁切口，12h后生理盐水4mL/Kg尾静脉注射。

检测指标：血清TNF-α、IL-8、IL-6，肺组织肺泡和肺泡间隔的形态。

（3）重症急性胰腺炎（SAP）大鼠模型：大鼠于术前12h禁食,自由饮水,g/L水合氯醛（4mg/Kg）腹腔内注射麻醉,麻醉后固定,消毒,铺巾,上腹正中切口无菌条件下开腹。提起胃十二指肠,显露胰腺,确认胰胆管,用小动脉夹暂时夹闭近肝门处胆管阻断胆汁流,4.5号头皮针经十二指肠壁插入胰管入十二指肠开口处,逆行穿刺胰胆管,用微量注射泵注入5%牛磺胆酸钠1mL/Kg,注射速度0.2mL/min。拔出穿刺针后，动脉夹夹闭穿刺点约5min,见到胰腺组织明显水肿、充血,被膜下散在出血,胰腺成暗红色后,去除小动脉夹,将各器官纳入正常解剖位置分层关闭腹腔。术后立即腹腔注射生理盐水2mL,每12h重复1次。

检测指标：观察大鼠术后一般情况如进食、活动度、呼吸以及活杀后胰腺充血水肿、肠管水肿、腹水情况和肺脏体积、肺表面充血等指标。胰腺组织，光学显微镜观察组织病理学改变，观察胰腺病理组织水肿、炎症、出血和坏死。血清HMGB1和HSP70。

（4）系统性红斑狼疮（SLE）模型：SLE模型鼠为EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因小鼠，雌性，30-40g。

检测指标：血清生化指标：肾功能指标肌酐（Cr）尿素氮（BUN），肾组织病理形态观察，术后一般情况如进食、活动度、被毛松弛及皮下水肿等情况。

（5）肠缺血再灌注损伤大鼠模型：大鼠于模型制备前24小时禁食不禁水，称重后给予腹腔注射10%水合氯醛(30mg/g体重)麻醉后，实验台上仰卧固定，腹部脱毛后取腹部正中切口进腹，暴露肠系膜上动脉(superiormesentericartery，SMA)，用无创夹夹闭其根部45分钟，松夹即为再灌注。在进行SMA夹闭期间，间断地向腹腔内注射等渗盐水，总量约15-20ml/kg，以预防或减轻在松开动脉夹后出现的一过性低血容量反应。待肠系膜上动脉搏动恢复后记录再灌注时间。上述操作在无菌条件下进行。

检测指标：光学显微镜下观察小肠形态学变化。血清细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6。P53基因表达：CD4、CD3、CD8T淋巴细胞及IgA浆细胞中P53表达。

二、血必净作用机制1.血必净抗炎机制2.血必净免疫调节机制

3.血必净内皮细胞保护机制

TIMPs：金属蛋白酶组织抑制剂，

MMPs：基质金属蛋白酶

TIMP-1/MMP-9的比例已被证明与脓毒症患者的存活率密切相关

皮素-1（ET-1）：可以激活促炎机制，增强超氧阴离子的产生和细胞因子的释放

高水平的iNOS衍生一氧化氮在脓毒症的发展中起着双重作用，因为它具有杀菌和血管舒张作用；它可能会导致血管扩张诱导的体温过低，并在脓毒症晚期出现致命的低动力状态

4.血必净抗氧化应激机制炎症导致氧化应激，因为产生活性氧，包括丙二醛和髓过氧化物酶(MPO)。因此，为了避免过量ROS产生的有害影响，免疫细胞必须产生足够量的抗氧化剂，如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)。三、血必净研究现状

血必净注射液具有拮抗细菌内毒素、抑制炎症因子的过度释放、改善凝血功能障碍、改善组织微循环、改善免疫功能紊乱等药理作用。

1.血必净中生物活性成分研究

XBJ注射液中30种成分含量差异显著。，化合物羟基红花黄色素A(A6)、氧芍药苷(A7)、洋川芎内酯I(A20)和苯甲酰芍药苷(A23)是主要成分，其含量分别为.、39.、94.、39.μg/mL。而化合物木犀草素(A22)、丹皮酚(A27)、丁烯基苯酞(A28)和丹参酮(A30)的含量相对较低，其含量分别为0.、0.、0.、0.μg/mL。

2.血必净注射液中的核因子-κB抑制剂

NF-κB转录因子属于一个密切相关的蛋白质二聚体家族，被认为是免疫系统中诱导型转录的关键介质。

NF-κB途径可能主要通过两种不同的途径激活，称为经典途径和替代途径。经典的激活方式依赖于IκB激酶(IKK)复合物的活性，包括IKKα、IKKβ和IKKγ，随后IκBα的磷酸化、IκBα泛素化和降解，并且通常导致p65/p50二聚体的核定位。通过NF-κB诱导激酶(NIK)和IKKα的替代途径导致p磷酸化，导致p52易位到RelB复合物的细胞核中。p38MAPK和Toll样受体信号通路也能NF-κB激活途径。

3.血必净的器官保护作用

脓毒症的发病机制与全身炎症反应网络的紊乱有关。当免疫系统对现有感染反应过度时，炎症反应可能导致重要器官功能障碍，如肺、心脏、肾和肝。

（1）血必净通过HMGB1和RAGE介导的炎症信号通路来抑制脓毒症诱发的肺损伤

高迁移率族蛋白1(HMGB1)，从坏死和活化的免疫细胞中释放，作为促炎细胞因子进入细胞外环境，并作为晚期介质参与内毒素诱导的急性肺损伤的发展。

RAGE是HMGB1促炎活性的主要受体，通过HMGB1激活RAGE参与了脓毒症的调节。

XBJ可以抑制HMGB1和RAGE的表达和相互作用，减轻中性粒细胞浸润和细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的释放来减轻肺损伤的发展。

（2）血必净注射液通过SOCS1减轻细胞因子诱导的脓毒症大鼠炎症性肝损伤

血必净注射液能改善脓毒症大鼠肝组织的病理改变，降低脓毒症肝损伤大鼠的肝脏生化标记物水平，包括谷丙转氨酶和谷草转氨酶谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平。

细胞因子信号诱导SOCS1，一种可以抑制刺激其产生的信号通路的蛋白质。

SOCS-1在所有测试系统中抑制细胞因子信号，包括TNF-α和IL-6。血必净注射液上调了SOCS-1的表达，减轻炎症反应和肝损伤。

（3）血必净注射液促进脓毒症小鼠巨噬细胞M2极化

在JAK1-STAT6信号通路的参与下，用XBJ处理可以促进小鼠腹腔巨噬细胞从M1向M2表型的极化。在用JAK1或STAT6抑制剂治疗后明显减少。

给予XBJ后，磷酸化Janus激酶1(JAK1)和信号转导和转录激活因子6(STAT6)的表达显著增强。

（4）血必净注射后血浆中12种生物活性成分及其药动学研究

利用UHPLC-Q-OrbitrapHRMS法测定XBJ注射液中12种生物活性化合物，以研究其在大鼠体内的药动学。

XBJ注射液中十二种生物活性化合物（没食子酸、羟基红花黄色素A、氧化芍药苷、绿原酸、芦丁、木犀草苷、芍药内酯苷、金丝桃苷、迷迭香酸、阿魏酸、丹酚酸A和苯甲酰芍药苷）药代动力学研究。在2.5-10mg/kg范围内，XBJ注射液的药动学行为与剂量呈正相关。

（5）代谢组学方法揭示血必净注射液对脓毒症大鼠的影响代谢组学是对细胞过程小分子代谢物的科学研究，专注于代谢物浓度的变化，提供基因组学最下游的信息，发现与疾病相关的生物标志物、潜在机制或潜在治疗靶点。采用气相色谱/质谱代谢组学方法，并探讨其治疗脓毒症的靶点和机制。

高血糖是脓毒症期间的常见现象。XBJ能降低大鼠血糖，影响其他能量和葡萄糖相关代谢物如2-脱氧-D-半乳糖、2-脱氧-D-葡萄糖和左旋葡聚糖。

在脓毒症的早期，肌肉蛋白水解和蛋白质分解代谢加速。腐胺在细胞代谢和细胞蛋白质合成中起重要作用。

花生四烯酸是一种多不饱和ω-6脂肪酸，具有促炎活性，XBJ治疗可以降低花生四烯酸的含量。

代谢组学方法为确定代谢生物标志物和诊断或治疗脓毒症的靶点提供了一种有前途的方法。

4.血必净于抗生素协同作用于脓毒症

脓毒症是由宿主感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。由病原体引起的感染是脓毒症的触发事件，因此迅速启动适当的抗生素治疗以根除病原体是脓毒症治疗的基石。在根治病原感染后，宿主反应仍保持失调，因此减弱宿主反应也很重要。

临床和实验研究表明，血必净可抑制炎症介质的失控释放，缓解早期过度的先天免疫反应和潜在的累积性免疫抑制，减轻炎症和凝血之间的相互作用，保护内皮细胞，维持重要器官的生理功能。这些作用不同于抗生素疗法，并且是抗生素疗法的补充。

与XBJ或BIPM单一疗法相比，联合治疗后更多的氨基酸、甘油磷脂和酰基肉碱得到调节，显示出XBJ和BIPM的协同作用。

XBJ和BIPM的协同治疗影响了更多的代谢途径。

研究发现：关于这种组合的协同作用的主要包括:1)BIPM单一疗法调节脓毒症中氨基酸、甘油磷脂和酰基肉碱的代谢水平，但对鞘脂、胆汁酸和游离脂肪酸没有影响。2)与XBJ或BIPM单药治疗相比，联合治疗后更多的内源性代谢物和代谢途径被显著调节。3)脂类、氨基酸、酰基肉碱和胆汁酸的代谢是参与XBJ和BIPM协同作用的常见途径。

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